Carica Batterica Totale
a 22°C (5gg)
1ml in 15 cc P.C.A.
a 36°C (48h)
Limite x
Legge: a 36°C non più di 10 U.F.C./ml
a 22°C non più di 100 U.F.C./ml
Coliformi Totali
100cc filtrati su
membrana su Endo brodo
a 35°C (18-24h)
Limite x
Legge : assenti in ml 100; non
più del 5% dei campioni esaminati nell’arco dell’anno e non più di due campioni
consecutivi prelevati nello stesso posto, possono eccedere tale limite;
comunque il contenuto in coliformi totali non può mai essere superiore a 5
U.F.C. / 100 ml
Coliformi Fecali
100cc filtrati
su membrana su mezzo M.F.C.
a 44°C (24h)
Limite x Legge Zero
Streptococchi fecali
100cc filtrati su
membrana a contatto con mezzo m-Eutercococcus agar oppure
KFS streptococcus agar
a 35° (48h)
Limite x
Legge Zero
CONTA TOTALE NELLE ACQUE
Scopo: ricerca della flora batterica che si sviluppa a 36°C e a 22°C.
Riferimento: IRSA 7050/94.
Tecnica: semina in agar germi - IRSA 6000/94.
Terreno di coltura: Plate Count Agar. Conservabilità del terreno in
provettoni o beute per non più di un mese.
Procedimento: seminare in doppio sul fondo delle capsule Petri
vuote 1 ml di acqua, versare circa 15 ml di Plate Count Agar sciolto e
mantenuto a 45°C, mescolare e far solidificare.
Incubare: a 36 +/-1°C per 48 h
a 22 +/-1°C per 5 giorni.
Lettura: contare tutte le colonie e farne la media.
Espressione dei risultati: <1-> 300 UFC/ml.
COLIFORMI TOTALI NELLE ACQUE
Scopo: ricerca dei coliformi totali nelle acque destinate al
consumo umano.
Riferimento: IRSA 7010/94 metodo B1.
Tecnica: membrane filtranti – IRSA 6040 metodo B.
Terreno
di coltura: m Endo Agar Les; contiene
tensioattivi (sodio laurilsolfato) ed un colorante (fucsina basica) che
ostacolano la crescita dei batteri Gram+.
Procedimento: filtrare 100 ml dell’acqua in esame dopo averli
introdotti nel bicchiere del kit di analisi. Porre la membrana del kit a
contatto con il terreno di coltura. Incubare a 35°C per 18-24 ore.
Il
kit di analisi comprende un bicchiere graduato da 100 ml montato su di una
membrana sterile; dopo aver filtrato il campione mediante un sistema aspirante,
il bicchiere viene posato su un dischetto di plastica che svolge le funzioni di
una capsula Petri ed in cui viene precedentemente iniettato un terreno di
coltura. Esercitando una leggera pressione si provvede a rompere il bicchiere
in modo da lasciare la membrana a contatto con il terreno. Il dischetto viene
poi posto in un termostato per l’incubazione.
Lettura: contare le colonie rosso scuro con riflesso
metallico.
Prove di conferma
Colorazione di
Gram
1. Su un vetrino portaoggetti pulito
si deposita un piccolo quantitativo di batteri che va allargato e disperso
facendo il cosiddetto “striscio”.
2. Lo striscio va essiccato scaldando
leggermente il vetrino, dopodiché i batteri vanno uccisi (fissati) passando per
tre volte il preparato nella zona più calda della fiamma (le cellule vive non
assorbono il colorante).
3. Sullo striscio essiccato si fanno
cadere poche gocce di cristralvioletto che deve agire per un minuto, quindi si
lava con acqua per portar via l’eccesso di colore.
4. Si copre quindi il preparato con
tintura di iodio fortemente diluita per un minuto e poi si lava con acqua.
5. Per pochi secondi (dieci) si lava
con alcol: i batteri Gram – perdono il colore violetto mentre i Gram +, non
dotati di lipopolisaccaridi, lo mantengono; si rilava con acqua.
6. Per poter vedere i batteri Gram –
si colora il preparato con safranina lasciando agire per un minuto, dopodiché
si effettua un nuovo lavaggio.
Si
essicca il preparato e si osserva al microscopio a forte ingrandimento: i
batteri Gram + risultano blu scuro–viola, i Gram – rosa-rosso.
Prova
della catalasi
1. Isolare la colonia da saggiare
prelevandola con un’ansa precedentemente sterilizzata.
2. Stemperarla su di un vetrino
portaoggetti.
3. Aggiungere qualche goccia di acqua
ossigenata.
4. La presenza della catalasi è
segnalata dalla formazione di bolle di gas.
Nel
caso dei coliformi, i batteri osservati al microscopio devono essere Gram- e di
forma bastoncellare, la prova della catalasi deve avere esito positiva.
Espressione
del risultato: 0->100 UFC/100 ml.
COLIFORMI FECALI NELLE ACQUE
Scopo: ricerca dei coliformi fecali nelle acque destinate
al consumo umano.
Riferimento: IRSA 7020/94 metodo B.
Tecnica: membrane filtranti – IRSA 6040/40 metodo B.
Terreno
di coltura: mFC Agar.
Procedimento: filtrare 100 ml dell’acqua in esame dopo averli
introdotti nel bicchiere del kit di analisi. Porre la membrana del kit a
contatto con il terreno di coltura. Incubare a 44°C per 24 ore.
Lettura: contare le colonie blu; per il riconoscimento di
questo tipo di coliformi si ricorre alla loro particolare caratteristica di
essere termotolleranti.
Espressione
del risultato: 0->100 UFC/100 ml.
STREPTOCOCCHI FECALI NELLE ACQUE
Scopo: ricerca degli streptococchi fecali nelle acque
destinate al consumo umano.
Riferimento: IRSA 6040 metodo B.
Tecnica: membrane filtranti - IRSA 6040/94.
Terreno
di coltura: m-Enterococcus Agar/KF
Streptococcus Agar (conservabilità delle piastre in frigotifero: 1 settimana).
Il terreno KF contiene sodio azide (NaN3), un potentissimo
battericida che ha il compito di uccidere tutti i microrganismi diversi dagli
streptococchi (che sono tra i pochi ceppi in grado di resistergli).
Procedimento: filtrare 100 ml dell’acqua in esame dopo averli
introdotti nel bicchiere del kit di analisi.Asportare con pinzette sterili la
membrana del kit e porla a contatto con il terreno precedentemente preparato
(la semina su KF non va effettuata per inclusione ma per contatto). Incubare a 35°C per 48 ore.
Lettura: contare le colonie rosse.
Prove di conferma
Colorazione di
Gram
Prova
della catalasi
Idrolisi dell’esculina
· Trasferire le membrane su cui si
sono sviluppate colonie su di un terreno all’esculina (composizione: esculina,
citrato ferrico, agar; conservabilità delle piastre in frigorifero: 1 mese).
· Incubare a 41°C per 20-40 minuti.
· Lettura: si considerano colonie di
streptococchi fecali le colonie in corrispondenza delle quali sul terreno
all’esculina compare un alone nero marrone.
Espressione
del risultato: 0->100 UFC/100 ml.
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