METODOLOGIE PER LE ANALISI MICROBIOLOGICHE

Carica Batterica Totale

a 22°C (5gg)
1ml in 15 cc P.C.A.
a 36°C (48h)

Limite x Legge: a 36°C non più di 10 U.F.C./ml
a 22°C non più di 100 U.F.C./ml

Coliformi Totali

100cc filtrati su membrana su Endo brodo

a 35°C (18-24h)

Limite x Legge : assenti in ml 100;
non più del 5% dei campioni esaminati nell’arco dell’anno e non più di due campioni consecutivi prelevati nello stesso posto, possono eccedere tale limite; comunque il contenuto in coliformi totali non può mai essere superiore a 5 U.F.C. / 100 ml

Coliformi Fecali

100cc filtrati su membrana su mezzo M.F.C.

a 44°C (24h)

Limite x Legge Zero

Streptococchi fecali

100cc filtrati su membrana a contatto con mezzo m-Eutercococcus agar oppure
KFS streptococcus agar

a 35° (48h)

Limite x Legge Zero

CONTA TOTALE NELLE ACQUE

Scopo: ricerca della flora batterica che si sviluppa a 36°C e a 22°C.

Riferimento: IRSA 7050/94.

Tecnica: semina in agar germi - IRSA 6000/94.

Terreno di coltura: Plate Count Agar. Conservabilità del terreno in provettoni o beute per non più di un mese.

Procedimento: seminare in doppio sul fondo delle capsule Petri vuote 1 ml di acqua, versare circa 15 ml di Plate Count Agar sciolto e mantenuto a 45°C, mescolare e far solidificare.

Incubare: a 36 +/-1°C per 48 h
a 22 +/-1°C per 5 giorni.

Lettura: contare tutte le colonie e farne la media.

Espressione dei risultati: <1-> 300 UFC/ml.

COLIFORMI TOTALI NELLE ACQUE

Scopo: ricerca dei coliformi totali nelle acque destinate al consumo umano.

Riferimento: IRSA 7010/94 metodo B1.

Tecnica: membrane filtranti – IRSA 6040 metodo B.

Terreno di coltura: m Endo Agar Les; contiene tensioattivi (sodio laurilsolfato) ed un colorante (fucsina basica) che ostacolano la crescita dei batteri Gram+.

Procedimento: filtrare 100 ml dell’acqua in esame dopo averli introdotti nel bicchiere del kit di analisi. Porre la membrana del kit a contatto con il terreno di coltura. Incubare a 35°C per 18-24 ore.
Il kit di analisi comprende un bicchiere graduato da 100 ml montato su di una membrana sterile; dopo aver filtrato il campione mediante un sistema aspirante, il bicchiere viene posato su un dischetto di plastica che svolge le funzioni di una capsula Petri ed in cui viene precedentemente iniettato un terreno di coltura. Esercitando una leggera pressione si provvede a rompere il bicchiere in modo da lasciare la membrana a contatto con il terreno. Il dischetto viene poi posto in un termostato per l’incubazione.

Lettura: contare le colonie rosso scuro con riflesso metallico.

Prove di conferma

Colorazione di Gram

1. Su un vetrino portaoggetti pulito si deposita un piccolo quantitativo di batteri che va allargato e disperso facendo il cosiddetto “striscio”.
2. Lo striscio va essiccato scaldando leggermente il vetrino, dopodiché i batteri vanno uccisi (fissati) passando per tre volte il preparato nella zona più calda della fiamma (le cellule vive non assorbono il colorante).
3. Sullo striscio essiccato si fanno cadere poche gocce di cristralvioletto che deve agire per un minuto, quindi si lava con acqua per portar via l’eccesso di colore.
4. Si copre quindi il preparato con tintura di iodio fortemente diluita per un minuto e poi si lava con acqua.
5. Per pochi secondi (dieci) si lava con alcol: i batteri Gram – perdono il colore violetto mentre i Gram +, non dotati di lipopolisaccaridi, lo mantengono; si rilava con acqua.
6. Per poter vedere i batteri Gram – si colora il preparato con safranina lasciando agire per un minuto, dopodiché si effettua un nuovo lavaggio.
Si essicca il preparato e si osserva al microscopio a forte ingrandimento: i batteri Gram + risultano blu scuro–viola, i Gram – rosa-rosso.

Prova della catalasi
1. Isolare la colonia da saggiare prelevandola con un’ansa precedentemente sterilizzata.
2. Stemperarla su di un vetrino portaoggetti.
3. Aggiungere qualche goccia di acqua ossigenata.
4. La presenza della catalasi è segnalata dalla formazione di bolle di gas.

Nel caso dei coliformi, i batteri osservati al microscopio devono essere Gram- e di forma bastoncellare, la prova della catalasi deve avere esito positivo.

Espressione del risultato: 0->100 UFC/100 ml.

COLIFORMI FECALI NELLE ACQUE

Scopo: ricerca dei coliformi fecali nelle acque destinate al consumo umano.

Riferimento: IRSA 7020/94 metodo B.

Tecnica: membrane filtranti – IRSA 6040/40 metodo B.

Terreno di coltura: mFC Agar.

Procedimento: filtrare 100 ml dell’acqua in esame dopo averli introdotti nel bicchiere del kit di analisi. Porre la membrana del kit a contatto con il terreno di coltura. Incubare a 44°C per 24 ore.

Lettura: contare le colonie blu; per il riconoscimento di questo tipo di coliformi si ricorre alla loro particolare caratteristica di essere termotolleranti.

Espressione del risultato: 0->100 UFC/100 ml.

STREPTOCOCCHI FECALI NELLE ACQUE

Scopo: ricerca degli streptococchi fecali nelle acque destinate al consumo umano.

Riferimento: IRSA 6040 metodo B.

Tecnica: membrane filtranti - IRSA 6040/94.

Terreno di coltura: m-Enterococcus Agar/KF Streptococcus Agar (conservabilità delle piastre in frigotifero: 1 settimana). Il terreno KF contiene sodio azide (NaN3), un potentissimo battericida che ha il compito di uccidere tutti i microrganismi diversi dagli streptococchi (che sono tra i pochi ceppi in grado di resistergli).

Procedimento: filtrare 100 ml dell’acqua in esame dopo averli introdotti nel bicchiere del kit di analisi.Asportare con pinzette sterili la membrana del kit e porla a contatto con il terreno precedentemente preparato (la semina su KF non va effettuata per inclusione ma per contatto). Incubare a 35°C per 48 ore.

Lettura: contare le colonie rosse.

Prove di conferma

Colorazione di Gram

Prova della catalasi

Idrolisi dell’esculina
· Trasferire le membrane su cui si sono sviluppate colonie su di un terreno all’esculina (composizione: esculina, citrato ferrico, agar; conservabilità delle piastre in frigorifero: 1 mese).
· Incubare a 41°C per 20-40 minuti.
· Lettura: si considerano colonie di streptococchi fecali le colonie in corrispondenza delle quali sul terreno all’esculina compare un alone nero marrone.

Espressione del risultato: 0->100 UFC/100 ml.

PRELIEVO DEI CAMPIONI

I prelievi sono stati realizzati alla sorgente dagli allievi, opportunamente addestrati, utilizzando bottiglie in vetro opaco preventivamente sterilizzate. Le analisi sono state effettuate nei giorni immediatamente seguenti il prelievo.
In ciascun anno i prelievi sono stati effettuati, di norma, tra la seconda metà di aprile e la prima metà di maggio, periodo corrispondente al raggiungimento da parte degli allievi delle capacità operative di analisi chimica e microbiologica in laboratorio. In caso di prelievo avvenuto in periodo diverso, la data è indicata nella tabella dei risultati.

Allievi nel laboratorio di microbiologia durante le operazioni di conteggio delle colonie microbiche sviluppate sui substrati inseminati con acque oggetto di indagine.