II plasmide così modificato dovrà appunto entrare in un batterio Escherichia-coli il quale comincerà a sintetizzare la proteina suddetta.
Per favorire l'introduzione di plasmidi nei batteri occorre modificare alcune proprietà chimico-fisiche delle pareti e delle membrane cellulari mediante l'impiego di sostanze chimiche le quali, associate a rapidi sbalzi di temperatura (elettroporazione); ne deriva così una temporanea permeabilizzazione delle cellule al DNA estraneo.
In seguito allo shock termico è necessario un periodo di incubazione in LB liquido, per l'espressione della proteina che rende il batterio resistente all'ampicillina. Questa si accumula nelle cellule trasformate ed inattiva l'antibiotico presente nelle piastre selettive, dove i batteri vengono messi a crescere. Grazie, all'uso di tali terreni si può notare che vi è emissione di fluorescenza verde solo dove è presente LB/ amp/ ara.
Le colonie di batteri trasformati, quando vengono esposte a radiazioni UV, emettono fluorescenza verde, prova dell'avvenuta sintesi della GFP.

LE BIOTECNOLOGIE

Con il termine biotecnologie si intendono tutte quelle tecnologie che utilizzano organismi viventi (batteri, lieviti, cellule vegetali o animali di organismi semplici e complessi) o loro componenti per ottenere quantità commerciali di prodotti utili, oppure per migliorare le caratteristiche di piante e animali o, ancora, per sviluppare microrganismi utili per usi specifici.
Hanno ricadute in molteplici settori: medicina, biologia, ambiente, energia, industria agroalimentare, zootecnia.
Le biotecnologie possono essere suddivise in "tradizionali" e "moderne". Le tradizionali raggruppano tutte quelle attività umane, esistitenti fin dagli albori della civilizzazione, che sono intervenute nell'evoluzione delle specie biologiche. Esempi di questi interventi sono la selezione da parte dell'uomo, tramite opportuni incroci, di piante e animali per l'alimentazione come mais, riso e bovini. La biotecnologia moderna conserva sempre la componente agroalimentare, ma ne aggiunge un'altra: quella biomedica. Inoltre nella moderna, la modalità d'intervento è completamente nuova perché opera sull'informazione genetica, cioè il DNA, apportando modificazioni non ottenibili in natura.
Questo tipo di biotecnologie produce OGM. Un OGM è un organismo geneticamente modificato, quindi un organismo biologico capace di riprodursi (non sempre), il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto si verifica in natura mediante l'introduzione di geni appartenenti ad un'altra specie. Un esempio possono essere le piante transgeniche. Vale a dire piante alle quali è stato modificato il DNA, con l'aggiunta di brevi tratti d'informazione genetica da organismi molto differenti, che possono conferire loro nuove proprietà, ad esempio la resistenza a parassiti.

L'ingegneria genetica

L'ingegneria genetica è una tecnologia che permette di trasferire i geni di un organismo in un altro che, in condizioni naturali, non avrebbe mai avuto l'occasione di possedere.
In natura esistono, infatti, ben definite barriere che non permettono alle specie di mescolarsi tra loro e di creare un mondo biologico continuo.
Ogni specie è fertile solo nel suo ambito per cui ognuna si è evoluta indipendentemente dalle altre e quindi possiede un pool genico originale. Questo corredo genetico può essere alterato artif icialmente,inserendovi un gene estraneo,senza che l'organismo ne venga troppo a soffrire.
Gli strumenti di lavoro di cui l'ingegneria genetica si serve sono:

1. gli acidi nucleici (DNA E RNA)dei quali è indispensabile conoscere struttura e funzione per poter individuare il gene che ci interessa trasferire
2. gli enzimi di restrizione,che consentono di tagliare selettivamente il DNA in punti prestabiliti (siti di restrizione), in modo da poter separare accuratamente il tratto di dna desiderato
3. altri enzimi (tra cui le DNA-ligasi) che consentono di legarlo al vettore prescelto o di modificarlo in vitro in modo conveniente alla propria necessità.
4. i vettori molecolari (plasmidi) che consentono il trasporto del gene nella cellula ospite,in modo che possa poi integrarsi nel cromosoma cellulare e quindi essere espresso,oppure che sia in grado di auto replicarsi ed esprimersi automaticamente
5. gli organismi ospiti più comuni (batteri,lieviti,cellule animali)dotati di peculiari caratteristiche genetiche o biochimiche,che li rendono più adatti a determinare applicazioni pratiche e a ospitare determinati vettori.

Gli acidi nucleici

Il DNA o acido desossiribonucleico è la molecola fondamentale di tutta la materia vivente. Si trova nel nucleo di ciascuna cellula e determina la forma e le funzioni dell'organismo intero; inoltre trasmette l'informazione genetica da una generazione alla successiva.

Watson e Crick, due scienziati rispettivamente americano ed inglese, negli anni Cinquanta, furono in grado di dedurre che il DNA è una doppia elica molto lunga e spiralizzata. Ogni base azotata forma un legame covalente con la molecola di zucchero posta nel tratto di montante adiacente ad essa. Le basi appaiate si incontrano sull'asse centrale dell'elica e sono unite da legami idrogeno, legami relativamente deboli. Del codice genetico vengono fatte delle copie che possano essere usate dagli operatori della sintesi proteica, i ribosomi. Queste copie sono costituite da molecole di RNA, l'acido ribonucleico. Anche l'RNA è un acido nucleico formato dall'unione di nucleotidi, come il DNA, rispetto al quale presenta però importanti differenze:

Per esplicare le proprie funzioni biologiche l'informazione genetica (DNA) deve convertirsi in una proteina o in un enzima funzionale:ciò richiede la trascrizione del gene in una copia di RNA (mRNA) che,trasportato nel citoplasma,dirige la sintesi della proteina codificata dal gene stesso.Questo processo di sintesi proteica necessita di una traduzione, in quanto il codice genetico è formato dalla disposizione sequenziale di quattro nucleotidi, mentre le proteine sono formate da catene di amminoacidi, uniti in sequenze secondo le precise istruzioni impartite dal DNA gnomico stesso.La traduzione richiede la partecipazione di tutti i tipi di RNA: oltre all'RNAm,intervengono l'RNAr costituente i ribosomi e l'RNAt che veicola i diversi amminoacidi ai ribosomi e garantisce la fedeltà del processo di traduzione(o sintesi proteica

La sintesi proteica

La sintesi proteica ha inizio quando l'mRNA, dopo essere stato trascritto, giunge nel citoplasma dove aderisce alla subunità ribosomiale più piccola. Poi un tRNA va a collocarsi con il suo anticodone di fronte al codone dell'mRNA complementare. Nei procarioti il tRNA con anticodone UAG è accompagnato da Fmet, che risulterà essere il primo amminoacido del polipeptide in formazione. In seguito la subunità più grande . aderisce a quella più piccola e il tRNA va a disporsi nel sito P. L'energia necessaria a questo passaggio è fornita dall'idrolisi di ATP in ADP.
Ora il secondo codone va a disporsi davanti al sito A della subunità maggiore, e un tRNA andrà ad inserirsi nell'mRNA e andrà ad occupare con il suo amminoacido(che formerà legame peptidico con Fmet)il sito A.
Il primo tRNA si libererà e il secondo andrà ad occupare il sito P. Il ribosoma si sposta ed entrerà un nuovo tRNA nel sito A,che si comporterà come il secondo. La sintesi termina quando si incontrerà una sequenza STOP e allora le subunità si separeranno e il polipeptide verrà immagazzinato in vescicole e trasportato nelle diverse cellule.

Gli strumenti

Per creare un organismo geneticamente modificato, è necessario disporre innanzitutto di un plasmide ingegnerizzato. Un plasmide è un segmento circolare di DNA a doppio filamento non cromosomico, non contenuto, cioè, nel cromosoma dell'individuo. I plasmidi sono tipici dei butteri e, in biotecnologie, grazie alla loro capacità di aprirsi per accogliere geni provenienti da corpi estranei e di autoduplicarsi, sono usati come vettori, al fine di trasferire geni da un individuo ad un altro. Se il plasmide è già stato modificato mediante l'aggiunta di nuove sequenze nucleotidiche si dice che esso è ingegnerizzato. Nel protocollo della trasformazione batterica, il cui obiettivo è quello di rendere fluorescente (alla luce di una lampada a raggi UV) un comunissimo Escherichia-coli, il plasmide ingegnerizzato è composto da:

La GFP (green fluorescent protein) è un polipeptide, tipico di alghe marine e meduse,che rende fluorescente l'individuo che la possiede. Il gene d'interesse che codifica per tale proteina deve dunque essere necessariamente presente nel plasmide. La sequenza ORI è costituita da alcuni nucleotidi il cui compito è quello di dare il segnale d'inizio per la sintesi della GFP.
L'AraC è un gene di regolazione; esso codifica, cioè, per particolari proteine di regolazione dette repressori, che favoriscono oppure bloccano la trascrizione di RNA messaggero. Quando nel terreno di coltura è presente l'arabinosio (uno zucchero), che funge da induttore, questo si lega al repressore che si trova attaccato ad un particolare sito della molecola di DNA detto operatore, e lo stacca, permettendo all'RNA polimerasi di iniziare il suo lavoro.
E' necessario inoltre aggiungere un gene per la resistenza agli antibiotici perché, una volta terminato il procedimento, le colture di batteri vengono posti in una soluzione in cui è presente ampicillina ed il tutto viene posto in una stufetta. I batteri che sopravvivranno a quest'ultimo passaggio, saranno quelli che avranno ricevuto il plasmide. Il plasmide così modificato dovrà appunto entrare in un batterio Escherichia-coli il quale, non riconoscendo il gene estraneo a causa dell'universalità del codice genetico, comincerà a sintetizzare la proteina suddetta.

Il procedimento

Ovviamente, per far entrare il plasmide nel batterio, occorre seguire un procedimento molto preciso e delicato.
La trasformazione batterica è stata messa a punto proprio per facilitare l'introduzione di plasmidi nei batteri, processo che in natura avviene in misura minima. Ciò si ottiene modificando alcune proprietà chimico-fisiche delle pareti e delle membrane cellulari con l'impiego di sostanze chimiche (CaCl2), associate a rapidi sbalzi di temperatura (elettroporazione); ne deriva così una temporanea permeabilizzazione delle cellule al DNA estraneo. In seguito allo shock termico è necessario un periodo di incubazione in LB liquido, per l'espressione della proteina che rende il batterio resistente all'ampicillina. Questa, codificata a livello genico nel p£LO appena entrato nelle cellule trasformate, si accumula in esse ed inattiva l'antibiotico presente nelle piastre selettive, dove i batteri vengono messi a crescere. Grazie all'uso di tali terreni si può notare che vi è emissione di fluorescenza verde solo dove è presente LB/ amp/ ara. Tale risultato prova il ruolo dell'arabinosio come induttore del meccanismo che regola la sintesi della GFP. Le colonie di batteri trasformati, quando vengono esposte a radiazioni UV, emettono una fluorescenza verde, prova dell'avvenuta sintesi della GFP.