Una volta isolato il gene codificante per il repressore dell’idrogenasi occorre che questo entri all’interno di Helicobacter pylori il quale poi, una volta assimilata la nuova sequenza, comincerà a produrre il repressore.
Per far ciò è opportuno fare ricorso alle biotecnologie. Avremmo innanzitutto bisogno di un plasmide.
Un plasmide è un segmento circolare di DNA a doppio filamento non cromosomico, cioè non contenuto nel cromosoma del batterio.
I plasmidi sono tipici dei batteri e, in biotecnologie, grazie alla loro capacità di aprirsi per accogliere geni provenienti da altri organismi e di autoduplicarsi, sono usati come vettori, al fine di trasferire geni da un organismo all’altro.
Al fine di inserire il gene, precedentemente estratto dal DNA di Helicobacter pylori, in un plasmide vettore bisognerà far aprire quest’ultimo in un punto grazie all’attività dello stesso enzima di restrizione utilizzato per isolare il gene da inserire.
Il punto di taglio sarà situato in una zona del plasmide detta MCS. Infatti la maggior parte dei plasmidi è provvista di una regione detta MCS (multi cloning site, sito di multi clonaggio), che contiene, in poche centinaia di paia di basi, tutti i siti di taglio dei principali enzimi di restrizione.
Dopo aver fatto ciò si deve porre il plasmide ‘aperto’ in una soluzione contenente il gene d’interesse e l’enzima ligasi, quest’ultimo legherà le estremità del gene isolato con quelle del plasmide vettore, grazie alla complementarietà creata dall’utilizzo di un unico enzima di restrizione, inserendo così il gene all’interno del plasmide.
Un plasmide ricombinato dovrà inoltre contenere: una sequenza ORI, il promotore del gene inserito ed una sequenza che renda il batterio resistente all’ampicillina, essa permette la selezione dei batteri che hanno assimilato il plasmide.
Infine bisognerà inserire il vettore all’interno di Helicobacter pylori.
Per fare ciò bisogna permettere alle molecole di DNA ricombinate di attraversare la membrana rendendola temporaneamente permeabile. Ciò si può fare mediante metodi fisici. Quello che dà migliori risultati è l’elettroporazione, questo metodo consiste nel sottoporre il microrganismo a rapidi e ciclici sbalzi di temperatura che causeranno, momentaneamente, la formazione di pori.
Nel contempo alcune colture di Helicobacter pylori non modificato verranno coltivate in appositi contenitori denominati bioreattori da cui si estrarrà l’idrogenasi che ‘bloccherà’ temporaneamente l’azione antibiotica per permettere la diffusione del plasmide ricombinato.
Per procedere alla fase di recupero e purificazione dell’enzima bisognerà effettuare la cromatografia per affinità. Il materiale grezzo viene fatto passare su di una colonna contenente una resina inerte a cui sono stati legati degli anticorpi specifici. La proteina viene trattenuta dagli anticorpi legati alla resina ed immobilizzata sulla colonna, mentre tutti gli altri componenti della sospensione vengono allontanati.
In una seconda fase il prodotto d’interesse viene separato dalla resina mediante eluizione e recuperato in forma pura.

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