INTRODUZIONE

Nel nord Italia, fitoplasmosi a carico della vite sono ben note dall’inizio degli anni’80, quando fu individuata la presenza di viti affette da flavescenza dorata (FD).
La malattia, a motivo della sua grande epidemicità, è inclusa negli elenchi delle “malattie di quarantena”, dalle legislazioni fitosanitarie di tutto il mondo.
La pericolosità della malattia è legata alla elevatissima efficienza della trasmissione, da vite a vite, ad opera del suo vettore, la cicalina di origine nordamericana chiamata “Scaphoideus titanus”.
L’agente eziologico della flavescenza dorata è un fitoplasma appartenente alla classe dei “Mollicutes”.
Attualmente i viticoltori delle nostre zone cercano di prevenire la flavescenza dorata tramite l’uso di trattamenti chimici che mirano all’uccisione dell'insetto vettore.
Onde evitare la diffusione della malattia, le viti affette vengono estirpate dal terreno e successivamente viene svolto un controllo sulle viti circostanti.
Il nostro lavoro parte da un nuovo punto di vista, che non si basa sull'uso dei pesticidi, bensì utilizzando le biotecnologie, in particolare utilizzando un plasmide in cui  sono state inserite delle sequenze in grado di stimolare la produzione di fitoalessine, molecole organiche capaci di debellare la malattia.

LA MALATTIA

La flavescenza dorata è una pericolosa malattia della vite arrivata dagli Stati Uniti ed osservata per la prima volta in Francia, nella zona dell'Armagnac, nel 1955, poi in Corsica nel 1970 e nell'Aude nel 1982. In Italia, invece, la flavescenza dorata è stata segnalata per la prima volta in Oltrepò pavese nel 1973. Questa  malattia temuta soprattutto al Nord, si sta rapidamente diffondendo anche in altre regioni viticole. Quando si presentano i sintomi è già troppo tardi, la vite infetta è compromessa.  I sintomi appaiono nel luglio dell'anno seguente l'infezione. Con l'avanzare della stagione si rendono sempre più manifesti, fino a raggiungere la loro massima espressione in tarda estate, autunno. Cambiano da varietà a varietà, specialmente tra vitigni rossi e bianchi, ma alcune caratteristiche sono: foglie arrossate (nelle varietà rosse) o ingiallite (nelle varietà bianche), arrotolate e fragili; i tralci sono scarsamente lignificati e a portamento cadente; i grappoli si seccano e cadono. Raramente la pianta infetta muore; la flavescenza dorata porta ad un graduale deperimento della pianta. Tuttavia se una pianta viene reinfettata diminuirà la sua probabilità di sopravvivenza all’inverno. In agricoltura convenzionale la lotta alla flavescenza si basa su diversi provvedimenti: trattamenti insetticidi sui vivai con organofosforici o piretroidi, trattamenti con acqua calda sul materiale legnoso raccolto, trattamenti estivi con insetticidi, eradicazione di piante malate o vigneti abbandonati e insetticidi regolatori di crescita. Per quanto riguarda l'agricoltura biologica, dall'88 si sta testando l'efficacia degli insetticidi utilizzabili in biologico. Nessuno dei questi prodotti in prova ha dato risultati sufficienti. Attualmente in Italia il Decreto Ministeriale del 31.5.2000 “Misure per la lotta obbligatoria contro la Flavescenza dorata della vite” introduce la lotta obbligatoria contro l’insetto vettore su tutto il territorio nazionale, non solo nelle aree già infette, ma anche in quelle esenti. Normalmente i trattamenti insetticidi da effettuare sono due; uno a metà giugno, l'altro tre settimane dopo (primi di luglio).
VETTORE
L'insetto vettore è la cicalina Scaphoideus titanus. E' un insetto che compie una generazione all'anno: gli adulti depongono le uova a fine estate sotto la corteccia, nel terreno e in anfratti. Le uova si schiudono verso maggio per un periodo che dura 6-12 settimane. I primi adulti appaiono in luglio e generalmente scompaiono alla fine di settembre. Alla schiusura delle uova le larve non sono ancora vettori della flavescenza, per diventarlo devono nutrirsi almeno una volta su materiale vegetale infetto. La trasmissione del fitoplasma è di tipo persistente: la cicalina diventa vettore della malattia solo dopo 3-4 settimane dal momento in cui si è alimentata su materiale infetto, il tempo necessario perché il fitoplasma raggiunga le ghiandole salivari, dopo di che è infettivo fino alla morte.

FITOALESSINE

Le fitoalessine sono composti antimicrobici a basso peso molecolare di natura non proteica, sintetizzati dalle piante ed in esse accumulati in seguito all’attacco da parte di microrganismi. Le fitoalessine appartengono alla famiglia degli stilbeni. Le fitoalessine sono assenti nelle piante sane, ma si concentrano in corrispondenza del punto di penetrazione del patogeno. Esse vengono sintetizzate, accumulate in vescicole lipidiche e quindi trasportate nei siti d’infezione dove sono in grado di limitare lo sviluppo del patogeno Le fitoalessine risultano coinvolte nei meccanismi di resistenza e/o tolleranza alle malattie da parte delle piante qualora soddisfino i seguenti requisiti:

1. devono essere presenti nelle parti della pianta invase dal patogeno;
2. devono essere presenti in concentrazioni tali da poter inibire la crescita del patogeno in vivo;
3. si devo accumulare nel momento idoneo a favorire il fenomeno di resistenza;
4. variazioni nelle concentrazioni di fitoalessine nelle piante dovrebbero corrispondere a variazioni nella sensibilità alle malattie.

La sintesi di fitoalessine nelle piante risulta quindi essere scatenata dall’interazione tra la pianta medesima e un agente patogeno, ma non solo. Esistono infatti anche fattori abiotici (agenti fisici o chimici), che, in condizioni sperimentali o in natura, sono in grado di indurre la pianta a sintetizzare fitoalessine. Si parla in generale di elicitori biotici e abiotici. I percorsi biosintetici di queste sostanze naturale sono noti nel dettaglio e i geni codificanti di alcuni enzimi chiave delle biosintesi sono stati clonati. L’introduzione di questi geni nel menoma di piante che non li posseggono, permette la creazione di nuova fitoalessine favorendo la difesa delle piante che producono costitutivamente una fitoalessina che normalmente non produrrebbe.

LA SEQUENZA CHE CODIFICA FITOALESSINE IN  VITIS VINIFERA E':

 ACGCGGGATTACTTTCCCTCTCTGCAACTCCTTCAACTTTGTGGTGTTATCTTGTGCAAT
 TATGGCAAAGAATGTGGCTGGGTCTCCCCTTGAGAGAAATGGGTTGGCCTCATTTGACCA
 AAAGCTGGCCATGGCCAAGCGCTGCTCTCATGAGGGCGTAGTTGCAGGAGCTAAGGCTGC
 AGTTGTTGCCAGCATTGCCACTGCCATAC.

Questa sequenza verrà inseguito chiamata “sequenza FVV”.

AGENTE EZIOLOGICO

L'agente eziologico dalla flavescenza dorata è un fitoplasma. I fitoplasmi sono batteri patogeni per le piante, che non possiedono pareti cellulari e che si possono sviluppare esclusivamente su tessuto vivo d’un ospite. I fitoplasmi consistono in cellule per lo più rotondeggianti, talvolta anche di forma irregolare, con un diametro di circa 0,2-0,5 _m e quindi molto più piccoli delle tipiche cellule batteriche (circa 1,0-2,0 _m).A differenza dei Virus, i fitoplasmi possiedono un proprio metabolismo, che tuttavia è assai ridotto, a tal punto che molte molecole vitali, indispensabili per la loro sussistenza, devono esser acquisite da cellule dell’ospite (vitalità biotrofica obbligata). Data la loro somiglianza con i micoplasmi patogeni dell’uomo, per lungo tempo i fitoplasmi furono definiti come “Mycoplasma-like-Organisms” (MLO), a partire dal 1994 venne introdotto l’attuale definizione terminologica. I fitoplasmi non si possono muovere autonomamente, ma si diffondono tramite insetti che fungono da vettori. Dopo l’assunzione del fitoplasma da parte dell’insetto, i microorganismi si moltiplicano anzitutto nelle cellule intestinali dell’ospite, arrivano poi nell’emolinfa e da lì penetrano negli organi interni, come il cervello e le ghiandole salivari. Se nelle ghiandole salivari si raggiunge una determinata concentrazione di fitoplasmi, questi possono essere trasferiti ad una pianta. Nella maggioranza dei casi gli insetti stessi non vengono danneggiati dai fitoplasmi. Essa si verifica normalmente in seguito alla puntura di un insetto infettato, che ha una concentrazione di fitoplasmi nelle ghiandole salivari sufficientemente elevata. Per le piante coltivate la trasmissione può avvenire anche con l’innesto. Le parti infettate della pianta sono soprattutto i vasi cribrosi del sistema conduttore (floema).

CLASSIFICAZIONE FITOPLASMI

I fitoplasmi vengono classificati sulla base delle caratteristiche molecolari del loro DNA. Tramite la tecnica AFLP si è potuto giungere all’analisi delle variazioni genomiche dei fitoplasmi. L’analisi dei frammenti amplificati ha permesso una buona discriminazione tra fitoplasmi appartenenti a diversi gruppi. Un’eccellente discriminazione si è ottenuta anche tra fitoplasmi appartenenti ad uno stesso gruppo, persino tra ceppi con una sequenza del 16S rDNA identica al 100%.

IDEA

Una possibile soluzione potrebbe essere indurre artificialmente la pianta a produrre le fitoalessine. Ricorrendo all'uso delle biotecnologie si può far produrre ad ogni essere vivente, nel nostro specifico a piante di vite, qualsiasi proteina quindi enzima che si voglia. Gli unici requisiti sono:

1. le sequenze FVV che codificano tali enzimi devono essere conosciute;
2. devono, inoltre essere conosciuti anche gli enzimi di restrizione specifici per le sequenze FVV;

Per quanto riguarda la vite si conoscono già sia le sequenze che gli enzimi di restrizione.
Per prima cosa bisogna isolare le sequenze FVV e quindi “tagliarle” con gli enzimi di restrizione. Inseguito occorre procurarsi un plasmide che verrà utilizzato come vettore per trasportare le nostre sequenze all'interno del DNA della vite. Un plasmide è un segmento circolare di DNA a doppio filamento non cromosomico, cioè non con contenuto nel cromosoma del batterio. I plasmidi sono tipici dei batteri e, in biotecnologie, grazie alla loro capacità di aprirsi per accogliere geni provenienti da altri organismi e di autoduplicarsi, sono usati come vettori, al fine di trasferire geni da un organismo all'altro.
Il plasmide prima di tutto va tagliato con gli stessi enzimi di restrizione usati per tagliare la sequenza FVV, poi deve essere inserito in una soluzione contenente la sequenza FVV e l'enzima ligasi. Quest'ultimo enzima serve per incollare la sequenza FVV alle due estremità del plasmide tagliato. La sequenza viene incorporata nel plasmide grazie alla complementarietà delle basi azotate. Inoltre nel plasmide ricombinato ci devono essere anche: una sequenza ORI, il promotore del gene inserito ed una sequenza che renda il batterio resistente all'ampicilina, essa permette la selezione dei batteri che hanno assimilato il plasmide.
Un altro passaggio fondamentale è inserire il plasmide ricombinato all'interno di un batterio. Per fare ciò bisogna permettere alle molecole di DNA ricombinante di attraversare la membrana rendendola temporaneamente permeabile. Nel nostro caso bisognerà utilizzare l'Agrobacterium tumefaciens. L'A. Tumefaciens è un batterio gram negativo, di forma bastoncellare, capace di infettare la piante attraverso la trasmissione di un segmento di DNA, definito T-DNA, che penetra all'interno delle cellule vegetali integrandosi nel loro genoma. Esistono diversi metodi fisici per inserire il plasmide all'interno dell'A. Tumefaciens. Quello migliore è l'elettroporazione, questo metodo consiste nel sottoporre il microrganismo a rapidi e ciclici sbalzi di temperatura che causeranno, momentaneamente, la formazione di pori.
Dopo aver creato una numerosa coltura di batteri con plasmidi ricombinati bisognerà aggiungerli in una soluzione fisiologica (che permetta la sopravvivenza dei batteri).
Questa soluzione potrà essere spruzzata sulla piante quando si vedranno i primi sintomi di flavescenza dorata (inizio luglio). Nel giro di poco tempo la pianta incomincerà a produrre le fitoalessine che andranno ad attaccare il patogeno.