INTRODUZIONE

Al giorno d’oggi, in cui lo stress è dilagante, le forme di malattie micotiche sono lunghe e fastidiose. Se non le si cura, non c’è da aspettarsi che vadano via da sole (ma solo che peggiorino) e a debellarle si impiega tempo e pazienza e si accresce lo stress.

Una delle micosi più diffuse è probabilmente la Candida.

Questa è una malattia che complica la vita, in special modo alle donne, perché, per essere curata, necessita di un attento controllo dell’alimentazione, l’assunzione di antimicotici e farmaci specifici spesso con effetti collaterali, il consumo di complessi multivitaminici.

Per tentare nuove strade terapeutiche, almeno per il discorso farmaceutico, abbiamo preso ispirazione dagli insetti. Molti di essi, infatti, sono dotati di un enzima, la CHITINASI, perché il loro esoscheletro è composto da CHITINA e durante le mute hanno bisogno di idrolizzare enzimaticamente il composto.

La chitina è anche presente nella parete cellulare dei funghi: noi riteniamo quindi che un farmaco a base di chitinasi abbia le caratteristiche per combattere efficacemente le micosi, uccidendo il fungo per shock osmotico.

Ringraziamo dunque gli insetti perché, senza di loro, questo progetto che ha come obiettivo quello di produrre un farmaco contro la Candida non potrebbe essere portato a compimento.

Nowadays, where stress is widespread and the forms of mycotic disease are long and annoying, if you don’t cure them, you can’t expect to recover, you can only get worse.

To cure them , you’ll need a lot of time and patience so stress will increase .

One of the most popular mycosis is probably the YEAST INFECTION. This is a disease that makes life difficult, specially women’s life, because to be cured, you need a careful diet control, intake of antimycotic and specific drugs, which have collateral effects, multivitaminic complexes, physical exercise (sometimes meditation is also suggested), a  frequent hygienic control of ourselves and of our partner.

To simplify the therapy,  at least as for the pharmaceutical aspect, we have been inspired by insects.

In fact, most of them, are equipped with an enzyme, the CHITINASI (chitin’s enzyme), because their exoskeleton is composed by chitin and during the ecdysis they need to hydrolyze the compound with enzymes.

We can find chitin also in fungi’s cell wall: we believe that a CHITINASI medicament has the features to fight mycotics effectively, killing fungi with an osmotic shock. So, we have to thank the insects because, without them, this project, which has the aim of producing a medicament against the yeast infection, won’t be realised.

L’infezione da candida è provocata dal lievito Candida albicans che è un parassita unicellulare appartenente al regno dei funghi. Candida è l’unico lievito ad essere patogeno per l’uomo ed è un organismo dimorfico, cioè che si manifesta in due forme metaboliche distinte. Normalmente è un simbionte che si instaura nell’intestino di tutti gli esseri umani in genere poco dopo la nascita e vi rimane sempre presente partecipando alla digestione degli zuccheri. Nella forma patologica diventa un parassita, crea una struttura molecolare molto lunga ed entra nel flusso sanguigno tramite la mucosa intestinale. In più del 60% dei casi l’origine della micosi è interna; il problema deriva dalla donna stessa, poiché vi è un’alterazione dell’ambiente che provoca lo squilibrio della flora vaginale. In questi casi la contagiosità è meno grave. In un terzo dei casi l’infezione proviene dall’esterno, per contatto sessuale o per contatto con oggetti infetti.

Favoriscono la candidosi:

·        alcuni farmaci come gli antibiotici, il cortisone, gli immunodepressivi, la pillola contraccettiva; dopo la loro assunzione continua per almeno quattro anni, più della metà delle donne ne è affetta.

·        il diabete

·        troppi glucidi nel sangue che diminuiscono le difese contro l’infezione.

·        la gravidanza (una donna su tre è colpita durante i primi quattro mesi e una donna su due al momento del parto.

·        alcune malattie endocrine o maligne.

·        l’igiene insufficiente o, al contrario, l’abuso di irrigazioni vaginali.

·        coiti ripetuti.

·        utilizzo non corretto di saponi acidi.

·        pantaloni stretti e collant.

Il 75% delle donne ha avuto o avrà nel corso della vita almeno un episodio di micosi vulvovaginale causata nel 98% dei casi dalla candida albicans. Circa il 5% della popolazione femminile adulta presenta 4 o più episodi di vulvovaginite micotica durante l’anno.

L’infezione da candida viene diagnosticata eseguendo un tampone vaginale che viene poi strisciato in un terreno di coltura. Dopo 48 ore si possono osservare le colonie del fungo a occhio nudo.

Il sintomo più costante e sgradevole è il prurito interno e permanente della vulva e dell’orifizio della vagina causato dalla liberazione della candidina da parte del patogeno. Si manifestano inoltre perdite biancastre dense e poco abbondanti, bruciori vaginali durante la minzione, esantema rosso che può estendersi alle cosce, esantema rosso intorno all’ano oppure macchie biancastre o giallastre all’interno della bocca. Inoltre i rapporti sessuali, sempre più dolorosi, non fanno che irritare maggiormente le pareti vaginali e portano al contagio del partner. Tuttavia nell’uomo il danno è più raro e sempre minore. Si manifesta sotto forma di prurito della pelle del glande o del prepuzio, che può essere ricoperto da numerose chiazze eritematose (rosse) spesso ricoperte di materiale biancastro, piccole, vellutate, lucide.

Le mucose rappresentano una componente fondamentale del sistema immunitario, dunque la candida rappresenta un forte attacco al sistema immunitario, e quindi apre la via a molte forme patologiche. La candida può provocare intolleranze alimentari e, a causa della stretta relazione tra intestino, sistema immunitario, sistema endocrino e sistema nervoso, sintomi come la depressione, allergie, sindrome premestruale, alopecia, insonnia, impotenza, patologie digestive, dermatiti, diabete, malattie autoimmuni, anoressia  e bulimia.

In contrasto con il gran numero di antibiotici e chemioterapici rivelatisi efficaci nel trattamento delle infezioni batteriche, la realizzazione di farmaci antifungini utilizzabili per via generale ha incontrato grandi difficoltà riferibili alla comune struttura eucariotica delle cellule fungine ed animali, che rende difficile l’individuazione dì bersagli metabolici o strutturali sufficientemente specifici.

Ecco,qui di seguito, i principali farmaci utilizzati nelle terapie antimicotiche:

Ø      I derivati polienici : sono il prodotto del metabolismo di alcune specie del genere Streptomyces, un actinomicete da cui possono essere estratti con adatti solventi. La scarsa idrosolubilità è, infatti, una delle maggiori limitazioni all’utilizzo di questi composti. I polieni (amfotercina B, nystatina) sono un gruppo di macrolidi prodotti anche per sintesi, caratterizzati da una serie di doppi legami alternati (tetraeni, eptaeni) e da un grande anello lattonico cui si riferisce l’attività antibiotica. Tali composti agiscono, dopo superamento della parete cellulare, danneggiando la membrana citoplasmatica delle cellule eucariotiche con conseguente alterazione della permeabilità osmotica e delle funzioni di trasporto di metaboliti essenziali.

La nystatina: isolata nel 1949 da Streptomyces noursei è stato il primo antibiotico polienico utilizzato estensivamente. Pur essendo attiva a basse concentrazioni (1,5-1,3 ng/ml) su un elevato numero di specie fungine, la sua tossicità, quando iniettata per via parenterale, e lo scarso o nullo assorbimento intestinale, quando assunta per via orale, ne precludono l’uso nella terapia delle micosi profonde.

L’amfotercina B : è un antibiotico a larghissimo spettro antimicotico. Nonostante sia presente in esso  elementi responsabili  di una possibile nefrotossicità (danni a livello dei tubuli renali) e possa causare iperpiressia, ipotensione, tromboflebiti, ipocalcemia ed epatite, ha rappresentato il primo composto efficace utilizzabile per il trattamento delle micosi profonde o disseminate e rimane l’antimicotico di scelta per la terapia empirica delle micosi. Un trattamento con cloruro di sodio si è dimostrato utile, quando possibile, nella prevenzione della nefrotossicità indotta dal farmaco. L’amfotercina B può causare, inoltre, anemia normocromica e normocitica associata a iposideremia riferibile a tossicità diretta sul midollo osseo o soppressione, reversibile, della produzione di eritropoietina

Ø      I derivati azolici :sono un gruppo di chemioterapici di sintesi, sia imidazolici (clotrimazolo, econazolo, ketoconazolo, miconazolo, tioconazolo) sia triazolici (itraconazolo, fluconazolo) tuttora in fase di espansione (butoconazolo, fenticonazolo, omoconazolo, saperconazolo, sulconazolo). Quasi insolubili in acqua, sono peraltro solubili nei solventi organici ed il potenziale effetto inibitorio è riferibile comunemente alla presenza di anelli aromatici in posizione N1 nell’anello azolico. I derivati azolici possiedono anche attività antibatterica, limitatamente ai batteri Gram-positivi.

Nella parete cellulare fungina, la chitina rappresenta un costituente fondamentale del setto che separa la cellula in accrescimento e riveste una particolare importanza nella transizione di forma tra micelio e lievito. Il ruolo cruciale nella cellula fungina e la sua assenza nelle cellule umane rendono i processi di sintesi della chitinasi e di idrolisi della chitina oggetti ideali per una potenziale terapia antimicotica a tossicità selettiva molto elevata.

La chitina rappresenta la sostanza protettiva degli insetti e di  altri artropodi, i più complessi invertebrati segmentati formati da appendici articolate, dei quali costituisce l'esoscheletro, ossia una struttura esterna che fa da sostegno per gli organi interni e in generale per l'intero corpo. Si trova anche in altre strutture superficiali di molti invertebrati. E' inoltre un costituente della parete cellulare di alghe e licheni, essendo questi ultimi il risultato della simbiosi tra alghe e funghi.

La chitina(dal greco kytòs, tunica, rivestimento) chimicamente é l'acetato di un polisaccaride, cioè un carboidrato, duro e resistente contenente azoto e zuccheri, legati tra di loro e con proteine da un legame di tipo B-1,4,lo stesso delle unità di glucosio che formano la cellulosa. Pertanto la chitina può essere considerata come una cellulosa nella quale al gruppo ossidrile, cioè il gruppo -OH presente in composti organici e inorganici, su ogni monomero sia stato sostituito un gruppo di acetilammina.- Con il termine monomero (dal greco una parte) si definisce una molecola semplice dotata di gruppi funzionali tali per cui sia in grado di combinarsi con altre molecole, identiche a sé o complementari a sé, per formare macromolecole.- I legami idrogeno fra polimeri adiacenti garantiscono alla sostanza una notevole durezza. La chitina è fibrosa ma non è sempre allineata nella stessa direzione, specialmente in prossimità di discontinuità come i buchi. Gli strati di chitina sono orientati in diverse direzioni in modo che gli sforzi siano uniformemente distribuiti.

La chitina, scoperta dal chimico e farmacista francese Henri Braconnot nel 1811,dopo la cellulosa è il più abbondante biopolimero presente in natura. Alcuni biopolimeri come il DNA formano la struttura a-eliche. Altri, tra i quali la chitina stessa, formano la struttura b-fogli, nota anche come struttura "pieghettata". Tale polisaccaride complesso per idrolisi con acidi si scinde in glucosammina e acido acetico.

La cellulosa, uno dei più importanti polisaccaridi costituita da un gran numero di molecole di glucosio unite tra loro da un legame glicosidico, e la chitina sono molto simili. L'unica differenza, molto ben visibile nella rappresentazione sottostante, è il gruppo ammidico al posto del gruppo alcoolico.

La biodegradabilità della chitina è piuttosto bassa.Tuttavia,parallelamente a questo, è aumentato l'interesse verso la sua trasformazione in altri prodotti(come ad esempio il chitosano, generato per deacetilazione della chitina in ambiente alcalino ad elevate temperature), e la ricerca dei suoi possibili utilizzi.

La chitinasi è un complesso di enzimi idrolitici che partecipano alla demolizione totale della chitina in D-glucosammina. Gli enzimi, catalizzatori biologici, sono proteine in grado di accelerare una specifica reazione chimica senza intervenire sui processi energetici che ne regolano la spontaneità. Le chitinasi sono presenti in numerose specie animali, come gli artropodi, i molluschi e anche in alcune specie fungine.

 
FORMULA DI STRUTTURA: CELLULOSA

FORMULA DI STRUTTURA:CHITINA

La coccinella è uno dei tanti insetti che hanno un esoscheletro che ricopre il corpo, all’interno del quale, appunto si trova la chitina. Questa struttura fisica implica che gli insetti come la coccinella abbiano all’interno del proprio genoma il gene che codifica per l’enzima chitinasi, così che questo possa agire per idrolizzare la chitina durante il processo di muta.

Per poter identificare quale sia la sequenza genica all’interno del Dna, che corrisponde all’enzima chitinasi e quindi clonarla, dobbiamo servirci di una libreria genomica.

Quando un organismo possiede un gene di particolare interesse o utilità, come in questo caso, ma non se ne conosce l’esatta ubicazione, è necessario preparare una libreria genomica, ossia la serie completa di frammenti di Dna che rappresentano la completa sequenza genica dell’organismo; in questo caso, così facendo otterremo tutti i frammenti che costituiscono il genoma della coccinella. Per costruire una libreria genomica dobbiamo utilizzare enzimi di restrizione per tagliare il Dna dell’organismo e inserire i frammenti ottenuti in vettori come i plasmidi; questi vengono poi introdotti in batteri, all’interno dei quali iniziano al loro moltiplicazione. Inizialmente ogni cellula batterica avrà incorporato un vettore con un frammento di Dna estraneo; i batteri di alcune di queste colonie avranno il gene d’interesse, che nel nostro caso corrisponde alla sequenza che codifica per l’enzima chitinasi.

Per individuare questa sequenza ci basiamo sulle proprietà degli acidi nucleici di formare coppie ben precise e di come i due filamenti di Dna riscaldati si separino per la rottura dei legami idrogeno che li univano. Se per esempio vengono mescolate molecole di Dna provenienti da fonti diverse, una volta che vengano riscaldate, queste si separano e subiscono delle collisioni casuali e se durante il raffreddamento  si incontrano due filamenti con sequenze quasi complementari, queste formeranno di nuovo la doppia elica di Dna, che viene definito ibrido. Preparando una sonda incorporando un isotopo radioattivo ad un breve segmento di Dna o Rna a filamento singolo che sia complementare alla sequenza nucleotidica del gene d’interesse e successivamente marcando la sonda con un indicatore fluorescente, potremo localizzare facilmente la sequenza che corrisponde al gene che codifica per la proteina che ci interessa.

Queste sonde possono essere molecole di Rna messaggero ( mRna) o frammenti ottenuti con l’azione di enzimi di restrizione, oppure sequenza geniche create in laboratorio.

Grazie alla realizzazione di una libreria genomica basata sulla mappatura del genoma della coccinella potremo identificare la sequenza nucleotidica la cui espressione genica corrisponde alla proteina chitinasi e clonare questi nucleotidi in modo da poter avere un’ampia produzione di questo enzima.

Una volta estratto dall'insetto il segmento di Dna che codifica per la proteina che idrolizza la chitina mediante enzimi di restrizione i quali vanno a tagliare la porzione interessata in quei determinati siti ad essi complementari, occorre che questo entri all'interno di un batterio il quale poi, una volta assimilata la nuova sequenza, comincerà a sintetizzare la sostanza necessaria a combattere le micosi.

Per far ciò è opportuno fare ricorso alle biotecnologie. Avremo innanzitutto bisogno di un plasmide. Un plasmide è un segmento circolare di DNA a doppio filamento non cromosomico, non contenuto, cioè, nel cromosoma dell’individuo. I plasmidi sono tipici dei batteri e, in biotecnologie, grazie alla loro capacità di aprirsi per accogliere geni provenienti da corpi estranei e di autoduplicarsi, sono usati come vettori, al fine di trasferire geni da un individuo ad un altro. Se il plasmide è già stato modificato mediante l’aggiunta di nuove sequenze nucleotidiche si dice che esso è ingegnerizzato.

In questo caso il plasmide ingegnerizzato deve essere costituito da:

·        Il gene d’interesse che codifica per l’enzima chitinolitico

·        Una sequenza ORI

·        Il promotore

·        Siti di restrizione

·        Una sequenza che renda il batterio resistente all’antibiotico ampicillina

·        Una sequenza che renda il batterio resistente alla tetraciclina.

Inserendoli gene d’interesse in modo da interrompere il gene per la resistenza alla tetraciclina ma non quello per la resistenza all’ampicillina, i batteri trasformati dovranno essere tetraciclina-sensibili, ma ampicillina-resistenti. I batteri che sopravvivranno in presenza di ampicillina ma che moriranno in presenza di tetraciclina saranno quelli che avranno ricevuto il plasmide.

Questo sarà entrato in un batterio il quale, non riconoscendo il gene estraneo a causa dell’universalità del codice genetico, comincerà a sintetizzare la proteinad’interesse. Ovviamente, per far entrare il plasmide nel batterio, occorre seguire un procedimento molto preciso e delicato.

Ciò si ottiene modificando alcune proprietà chimico-fisiche delle pareti e delle membrane cellulari con l’impiego di sostanze chimiche (CaCl ), associate a rapidi sbalzi di temperatura (elettroporazione); ne deriva così una temporanea permeabilizzazione delle cellule al DNA estraneo. In seguito allo shock termico è necessario un periodo di incubazione in LB liquido, per l’espressione della proteina che rende il batterio resistente all’ampicillina. La proteina per la resistenza all’ampicillina si accumula in esse ed inattiva l’antibiotico presente nelle piastre selettive, dove i batteri vengono messi a crescere.

Purificazione della chitinasi

Dopo aver coltivato i batteri ingegnerizzati in appositi contenitori denominati bireattori, si dovrà procedere alla fase di recupero e purificazione del prodotto mediante la cromatografia di affinità. Il materiale grezzo viene fatto passare su una colonna contenente una resina inerte a cui sono stati legati degli anticorpi specifici. La proteina ricombinante viene trattenuta dagli anticorpi legati alla resina ed immobilizzata sulla colonna, mentre tutti gli altri componenti della sospensione vengono allontanati; in una seconda fase il prodotto d’interesse viene separato dalla resina mediante eluizione e recuperato in forma pura.